EQUIPOS
El espectrofotómetro
Uno de los instrumentos principales del laboratorio de biología celular es el espectrofotómetro. Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromática (de un largo de onda particular) a través de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto le permite al fisiólogo realizar dos funciones:
1. Nos da información sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra. Esto podemos lograrlo midiendo la absorbancia (Abs) a distintos largos de onda (l) y graficar estos valores en función del largo de onda, formando un espectrograma. Como cada sustancia tiene unas propiedades espectrales únicas, distintas sustancias producen distintos espectrogramas. Esto se debe a que cada sustancia tiene un arreglo de átomos tridimensional particular que hace que cada sustancia tenga características únicas. Al ser expuestos a la luz del especrofotómetro, algunos electrones de los átomos que forman las moléculas absorben energía entrando a un estado alterado. Al recuperar su estado original, la energía absorbida es emitida en forma de fotones. Esa emisión de fotones es distinta para cada sustancia, generando un patron particular, que varía con el largo de onda usado. Dependiendo del largo de onda, será la cantidad de energía absorbida por una sustancia, lo que logra generar un espectro particular al graficar Abs vs l
2. Nos dice cuanta cantidad de la sustancia que nos interesa está presente en la muestra. La concentración es proporcional a la absorbancia, según la Ley Beer-Lambert: a mayor cantidad de moléculas presentes en la muestra, mayor será la cantidad de energía absorbida por sus electrones.
Cubetas
Las cuvetas son unos viales de plástico transparente o cuarzo que dejan pasar la luz. Los mejores para trabajos de investigación son las de cuarzo porque su interferencia al paso de la luz es mínimo. Son más costosas inicialmente pero bien tratadas pueden ser reusables. Las de plástico vienen con distintas características. Por lo general son desechables, aunque pueden reusarse. El tipo de cuveta plástica a usar depende del rango de luz en el que se van a analizar las muestras. Vienen unas para luz visible, que son las más económicas, y otras para el rango de visible a ultravioleta. Estas son más versátiles.
Ambos tipos de cuvetas deben manejarse con cuidado para evitar rallazos sobre la superficie por donde pasa la luz. Si la cuveta está rallada, los rayos de luz que incidan en la zona se difractan y no pasan por la muestra, por lo que puede dar lecturas de absorbancia erróneas. Esto es especialmente crítico cuando queremos determinar concentración en una muestra. Antes de tomar una lectura, debemos observar que la cuveta no tenga rallazos ni esté sucia. Si se ven marcas de polvo u otro tipo de sucio la cuveta debe limpiarse con papel tisú (Kimwipes). Si la cuveta se manipula mucho, debemos sostenerla usando papel tisú para evitar pegarle los aceites que normalmente tenemos en las manos. No debemos usar ningún otro tipo de papel para limpiar las cuvetas, puesto que pueden soltar fibras que pudieran caer en la muestra o rallar la superficie.
Las cuvetas viene en distintos volúmenes, desde 1 ml hasta 4 ml. El volumen a escoger depende de la cantidad de muestra disponible. Si la muestra disponible es poca o difícil de conseguir, lo mejor es usar una cuveta de menor volumen para perder la menor cantidad posible de la muestra. Por lo general, la muestra utilizada para hacer la lectura se pierde, sobre todo si es una sustancia bien sensitiva, como el ADN.
Pipetas y pipeteadores
Usamos las pipetas para medir volúmenes de líquidos de forma más precisa que con una probeta. Y son más versátiles, sobre todo al manejar volúmenes pequeños.
Las pipetas de bulbo son útiles para medir volúmenes que no requieren de mucha presición. Antes se usaban pipetas "Pasteur" de cristal a las que se les aditaba un bulbo de goma que se usaba para succionar el líquido. Ahora vienen en plástico desechable de una sola pieza y se consiguen con o sin calibración.
Las pipetas volumétricas vienen en distintos tamaños, desde 1 ml hasta 200 ml, y con distintas formas, de acuerdo al uso que se les dé. También vienen en distintos materiales como borosilicato y plástico, desechables o reusables, estériles o sin esterilizar. Algunas pueden ser esterilizadas en horno o autoclave. Para llenarlas se pueden usar bulbos de caucho, bombas manuales o eléctricas, o equipos de llenado. Las bombas eléctricas y los equipos de llenado son muy útiles si se está trabajando con múltiples muestras, pues minimizan la fatiga del técnico.
Las micropipetas son extremadamente útiles en los laboratorios de biotecnología. Estas permiten medir con presición volúmenes tan pequeños como 0.1 µl hasta 1 ml. Estas requieren de unos pipeteadores especiales que deben der tratados con mucho cuidado para evitar que se descalibren. Los pipeteadores vienen de distintos tipos. La mayoría pueden servir muestras individuales. Pero vienen los que pueden servir muestras múltiples, por medio de multicanales: pipetas que sirven 8 o 12 muestras a la vez. Estas son muy útiles al hacer pruebas de ELISA, donde se practican diluciones seriadas multiples, o para preparar reacciones de varias muestras distintas a la vez. Se usan en conjunto con platos de fosas múltiples.
Las puntas de micropipetas vienen con distintas características de acuerdo al uso que se les dé. Vienen con punta ancha, estrecha o aplanada, con o sin filtros contra aerosoles, estériles o sin esterilizar y pueden ser esterilizadas en autoclave.
Aparatos de electroforesis
Estos son unas cámaras que contienen un circuito eléctrico expuesto a un líquido electrolítico, llamado amortiguador. El aparato se usa para separar mezclas de moléculas grandes de acuerdo a su carga y/o su tamaño. La técnica consiste en inocular la muestra en un medio semisólido, la fase estacionaria, que se somete a un campo eléctrico, en una cámara donde en un extremo se encuentra un filamento que actúa como polo positivo, y en el extremo opuesto hay otro filamento formando el polo negativo. Las moléculas con cargas netas positivas se moverán hacia el polo negativo y las de carga negativa se irán hacia el polo positivo. Luego de la muestra ser tratada apropiadamente dependiendo del tipo de electroforesis, las moléculas que viajen hacia uno de los polos se separarán por tamaño, viajando más en la fase estacionaria las moléculas más pequeñas. El tipo y concentración de la fase estacionaria dependerá del tipo de moléculas que nos interesa correr.
Centrífugas
Son muy útiles para precipitar células y moléculas. Vienen en distintos tamaños y con distintas capacidades en el manejo de muestras. Este aparato somete la muestra a fuerzas de aceleración que obligan a las moléculas a concentrarse en el fondo del envase utilizado, separándolas del medio en que se encuentran. Incluso, bajo ciertos métodos se puede generar un gradiente de concentraciones dentro del mismo tubo, separando distintas moléculas a distintos niveles o fases dentro del tubo. Con ayuda de jeringas, se puede perforar la pared del tubo y extraer del mismo sólo aquella fase donde se encuentren las moléculas de interés.
Entre las centrífugas que usaremos durante el semestre están la centrífuga refrigerada, que nos va a permitir separar células de los medios de cultivo. El rotor de esta centrifuga puede sostener tubos de 50 ml, pero puede ser intercambiado por rotores que sostienen botellas de cultivo.
La microcentrífuga es una versión más pequeña de la descrita anteriormente. Es compacta, se coloca sobre la mesa y procesa muestras de hasta 2 ml. Es muy útil para precipitar ADN y otras sustancias que se trabajan en volúmenes pequeños.
Equipo de cromatografía
Haremos varias cromatografias al final del semestre. En una cromatografía buscamos separar uno o varios tipos de moléculas, relativamentre pequeñas, de una mezcla de sustancias o para purificar muestras. Existen varios tipos de cromatografías. La que se utilice dependerá del tipo de moléculas que buscamos aislar.
La cromatografía de capa fina es ideal para separar muestras pequeñas. Presenta dos componentes: una fase estacionaria y una fase móvil. La fase estacionaria consiste de una placa de vidrio o celulosa impregnada con polvo de silicato (vidrio molido extremadamente fino). Las muestras se colocan a un centímetro del borde inferior y se coloca en un tanque de revelado que contiene algun tipo de solvente en el fondo. La placa se coloca de forma que el solvente no toque directamente las muestras. La fase móvil consiste del solvente. El solvente a usarse dependerá de las propiedades químicas de los componentes de la mezcla.
El solvente sube por capilaridad por la superficie impregnada con las muestras. Los componentes de la mezcla comenzarán a migrar, según el grado de afinidad que tengan por el solvente y/o la fase estacionaria. Mientras más afín sea algún componente a la fase móvil, más rápido se moverá y más lejos llegará en su migración sobre la fase estacionaria.
En la cromatografía de columna se pueden separar volúmenes más grandes de muestras. Tambien tiene una fase estacionaria que consiste de un tubo conteniendo un material que separa la mezcla analizada. Los amortiguadores que se usan para lavar la columna constituyen la fase móvil.
El empaque de las columnas puede separar moléculas por su tamaño, por sus interacciones iónicas o por interacciones hidrofóbicas. El tipo de empaque a usar dependerá de las propiedades de la muestra.
Existen otros tipos de cromatografía más sofisticados, que se usan en laboratorios de investigación y en procesos de manufactura en varios tipos de industrias. Nosotros nos limitaremos a los descritos anteriormente.
Microscopio
El microscopio
es un instrumento que permite observar objetos que son demasiado pequeños para ser vistos a simple vista. El tipo más común y el primero que se inventó es el microscopio óptico. Se trata de un instrumento óptico que contiene dos o más lentes que permiten obtener una imagen aumentada del objeto y que funciona por refracción. La ciencia que investiga los objetos pequeños utilizando este instrumento se llama microscopia.
REACTIVOS
La pureza de los reactivos es fundamental para la exactitud que se obtiene en cualquier análisis. En el laboratorio se dispone de distintos tipos de reactivos (sólidos, líquidos o disoluciones preparadas) tal y como se comercializan.
| Reactivos sólidos |
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Reactivos líquidos
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Disoluciones preparadas
|
En general, las casas comerciales ofrecen un mismo producto con varias calidades. Es importante que cuando seleccionemos un reactivo su calidad esté en concordancia con el uso que se le va a dar.
Clasificación
En el laboratorio de análisis se utilizan reactivos de calidad analítica que se producen comercialmente con un alto grado de pureza. En las etiquetas de los frascos se relacionan los límites máximos de impurezas permitidas por las especificaciones para la calidad del reactivo o los resultados del análisis para las distintas impurezas. Dentro de los reactivos analíticos pueden distinguirse tres calidades distintas:
• Reactivos para análisis (PA): Son aquellos cuyo contenido en impurezas no rebasa el número mínimo de sustancias determinables por el método que se utilice.
• Reactivos purísimos: Son reactivos con un mayor grado de pureza que los reactivos “para análisis” .
• Reactivos especiales: Son reactivos con calidades específicas para algunas técnicas analíticas, como cromatografía líquida (HPLC), espectrofotometría (UV)…
Hay reactivos que tienen características y usos específicos como los reactivos calidad patrón primario, que se emplean en las técnicas volumétricas, o los patrones de referencia.
PICTOGRAMAS DE PELIGROSIDAD
·
Todo
laboratorio está formado por las siguientes áreas de trabajo:
·
Anexo
del laboratorio escolar (almacén).
·
Anexo
para guardado de equipo y material.
·
Anexo
de reactivos.
·
Mesas
de trabajo o áreas de experimentación.
·
Mesa
de trabajo principal, para el profesor.
·
Mesas
de trabajo secundarias, para los alumnos.
·
Campanas
de extracción y lavabos.
Instalaciones.
·
Hidráulicas.
·
De
gas.
·
Sanitarias.
·
Eléctricas.
SERVICIO
.
- Agua potable.
- Luz eléctrica.
- Instalaciones de gas.
- Instalaciones sanitarias.
- Campanas de extracción y
lavabos.
NORMAS
MATERIAL PERSONAL COTIDIANO OBLIGATORIO.
Bata larga (a la rodilla o pantorrilla) de algodón 100% y manga larga, con botones. Se recomienda que sea blanca.
Monogogles incoloros sin ventilación o con trampas.
Anteojos neutros de seguridad de policarbonato o vidrio endurecido con protección lateral.
Protector facial transparente de 20 cm de largo.
Guantes de látex para manejar ácidos débiles y cetonas.
Guantes de PVC para manejar ácidos y bases débiles.
Guantes de neopreno para manejar ácidos y solventes alifáticos.
Guantes de nitrilo para manejar solventes y derivados orgánicos.
Guantes térmicos de algodón o asbesto (para materiales calientes y fríos).
Respirador con filtros para: a) Vapores orgánicos y gases ácidos (código amarillo). b) Vapores orgánicos (código negro). c) Amoniaco y alcalinos (código verde obscuro). d) Humos (código violeta).
Escobillones de varios tamaños.
Fibra verde.
Detergente bajo en fosfatos.
Encendedor para mechero y/o cerillos.
Franela de algodón limpia.
Cinta para encubrir (masking tape) de 1.27 cm de ancho.
Toallas absorbentes de papel.
Rollo de papel higiénico blanco o caja de pañuelos desechables blancos.
Rollo de papel aluminio.
Marcador indeleble, preferentemente negro.
Tijeras rectas.
Percolador de 8 cm de diámetro.
Embudo de plástico de 8 cm de diámetro.
Normas generales
- No fumes, comas o bebas en el laboratorio.
- Utiliza una bata y tenla siempre bien abrochada,
así protegerás tu ropa.
- Guarda tus prendas de abrigo y los objetos personales
en un armario o taquilla y no los dejes nunca sobre la mesa de trabajo.
- No lleves bufandas, pañuelos largos ni prendas u
objetos que dificulten tu movilidad.
- Procura no andar de un lado para otro sin motivo y,
sobre todo, no corras dentro del laboratorio.
- Si tienes el cabello largo, recógetelo.
- Dispón sobre la mesa sólo los libros y cuadernos
que sean necesarios.
- Ten siempre tus manos limpias y secas. Si tienes
alguna herida, tápala.
- No pruebes ni ingieras los productos.
- En caso de producirse un accidente, quemadura o
lesión, comunícalo inmediatamente al profesor.
- Recuerda dónde está situado el botiquín.
- Mantén el área de trabajo limpia y ordenada.
Normas para manipular instrumentos y productos
Antes de manipular un aparato o montaje eléctrico, desconéctalo de la red eléctrica.
No pongas en funcionamiento un circuito eléctrico sin que el profesor haya revisado la instalación.
No utilices ninguna herramienta o máquina sin conocer su uso, funcionamiento y normas de seguridad específicas.
Maneja con especial cuidado el material frágil, por ejemplo, el vidrio.
Informa al profesor del material roto o averiado.
Fíjate en los signos de peligrosidad que aparecen en los frascos de los productos químicos.
Lávate las manos con jabón después de tocar cualquier producto químico.
Al acabar la práctica, limpia y ordena el material utilizado.
Si te salpicas accidentalmente, lava la zona afectada con agua abundante. Si salpicas la mesa, límpiala con agua y sécala después con un paño.
Evita el contacto con fuentes de calor. No manipules cerca de ellas sustancias inflamables. Para sujetar el instrumental de vidrio y retirarlo del fuego, utiliza pinzas de madera. Cuando calientes los tubos de ensayo con la ayuda de dichas pinzas, procura darles cierta inclinación. Nunca mires directamente al interior del tubo por su abertura ni dirijas esta hacia algún compañero. (ver imagen)
Todos los productos inflamables deben almacenarse en un lugar adecuado y separados de los ácidos, las bases y los reactivos oxidantes.
Los ácidos y las bases fuertes han de manejarse con mucha precaución, ya que la mayoría son corrosivos y, si caen sobre la piel o la ropa, pueden producir heridas y quemaduras importantes.
Si tienes que mezclar algún ácido (por ejemplo, ácido sulfúrico) con agua, añade el ácido sobre el agua, nunca al contrario, pues el ácido «saltaría» y podría provocarte quemaduras en la cara y los ojos.
No dejes destapados los frascos ni aspires su contenido. Muchas sustancias líquidas (alcohol, éter, cloroformo, amoníaco...) emiten vapores tóxicos.
Consideraciones generales
La disposición del laboratorio debe diseñarse con criterios de eficiencia. Por ejemplo, la distancia que deba recorrer el personal para llevar a cabo las distintas fases de los procesos analíticos ha de ser lo más corta posible, aun teniendo presente que tal vez haya que separar unos procedimientos de otros por motivos analíticos o de seguridad.
Las actividades genéricas pueden definirse como operaciones químicas "por vía húmeda" para las que es necesario disponer de un gran número de bancos fijos dotados de agua, electricidad, sumideros, campanas de humos, estanterías para los reactivos y espacio para la limpieza y almacenamiento del instrumental de vidrio, a diferencia de las "salas de instrumentos", donde son necesarios menos servicios (aunque deberán contar con un suministro adicional de gas por tuberías y tal vez una instalación eléctrica fija) y puede ser suficiente una combinación flexible de mesas/bancos móviles.
Pueden ser necesarias salas especializadas para el trabajo que requiere "aire limpio" (por ejemplo, el relacionado con algunos contaminantes ambientales), o para el trabajo con sustancias que han de manipularse con especial cuidado, por motivos de seguridad o para evitar la contaminación cruzada (por ejemplo, materiales radioactivos y algunas sustancias especialmente tóxicas), o para el almacenamiento y distribución de patrones de compuestos puros que se están analizando a niveles residuales en alguna otra parte del laboratorio. Una sala especializada para operaciones en gran escala o actividades de preparación de muestras en las que se desprende polvo, como por ejemplo molturación, mezcla o agitación, será muy conveniente, sobre todo si se prevé trabajar con analitos heterogéneos (por ejemplo, aflatoxinas en nueces o higos para las que a veces se necesitan muestras primarias de 30 kg).
Para facilitar una rápida evacuación en caso de incendio o cualquier otra emergencia, deben preverse por lo menos dos entradas/salidas en cada habitación, siempre que sea posible.
Control del medio ambiente
Un control adecuado de la temperatura, la humedad y el polvo es importante para el bienestar del personal, el funcionamiento de los instrumentos y la seguridad en el trabajo (por ejemplo, con disolventes inflamables). Los instrumentos ópticos suelen requerir unas condiciones de temperatura estables para funcionar debidamente. Es posible que el equipo electrónico precise unos niveles determinados de temperatura y humedad ambiental. Los ordenadores han de protegerse de campos magnéticos intensos provenientes de otros aparatos; los empleados o visitantes con marcapasos deberán evitar tales campos. Puede que sea necesario un sistema de agua fría de la red de abastecimiento o de refrigeración localizada para que ciertos aparatos funcionen debidamente. Los materiales de ensayo, reactivos y patrones habrán de almacenarse en condiciones reguladas. Algunas sustancias deben protegerse de la luz del sol o de las lámparas fluorescentes que las afectan. Las balanzas e instrumentos ópticos delicados necesitan protección contra las vibraciones (por ejemplo de los mezcladores, tambores y centrífugas) o incluso un soporte estabilizador. Todas estas necesidades han de identificarse y documentarse de manera que en el sistema de garantía de la calidad puedan incluirse procedimientos adecuados para regularlas y tomar las medidas oportunas.
Serán necesarios registros en los que conste que:
- las muestras se reciben, almacenan, manejan y analizadn en condiciones ambientales que no afectan negativamente a los análisis;
- los controles de la temperatura, la humedad y la luz en las zonas sensibles son adecuados para proteger las muestras, sus extractos, el personal y el equipo;
- se lleva un registro de los resultados del muestreo ambiental en los locales del laboratorio, en el que se anota también la velocidad de las corrientes de aire que pasan a través de las aberturas de las campanas de humos.
Control de la limpieza: Como en lo que concierne a cualquier otro aspecto de las actividades del laboratorio, la responsabilidad de las operaciones de limpieza deberá definirse claramente. Tanto el personal de la limpieza como el del laboratorio deberán tener instrucciones precisas sobre sus obligaciones respectivas en relación con: - la limpieza de los suelos, superficies verticales (por ejemplo, armarios, paredes, ventanas y puertas), superficies horizontales (por ejemplo superficies de trabajo, estanterías), equipo, interior de refrigeradores, congeladores, campanas de humos, almacenes de temperatura regulada;- control del contenido de refrigeradores, congeladores, campanas de humos, almacenes de temperatura regulada; - comprobación del funcionamiento del equipo de acondicionamiento de aire y extracción de polvo y de las campanas de humos; - lucha contra las plagas.
Yo como estudiante de ciencias naturales debo llevar la vestimenta reglamentaria:
(Foto obtenida de Google buscador de imágenes)
Acatar las normas y seguir la orientación del profesor.
A mis compañeros les recomiendo que hagan lo mismo para un mejor desempeño en el laboratorio de ciencias naturales.
